EAE模型是一種以特異性致敏的CD4+T細胞介導為主的，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周圍出現(xiàn)單個核細胞浸潤及髓鞘脫失為特征的自身免疫性疾病，是人類多發(fā)性硬化（MS）的理想動物模型，在臨床神經(jīng)免疫學的研究中具有重要意義。

實驗動物的選擇

國內(nèi)外學者試用多種易感動物建立EAE模型，以期闡明MS及EAE的發(fā)病機制，并為其病情的監(jiān)測、復發(fā)的預防、治療方案的選擇以及新療法或新藥物的篩選等提供可靠依據(jù)。本文就近年來EAE模型方面的研究綜述如下。

EAE模型1.1 品系

從鳥類到哺乳類的多種動物如雞、小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、羊、犬、猴等均可成功誘發(fā)EAE，但不同種屬或同一種屬不同品系動物的敏感性有很大差異。對EAE敏感的動物有Lewis、DA大鼠，PL/J、SJL/J小鼠，Hartley、Strain13豚鼠。雖然豚鼠對誘發(fā)EAE相當敏感，但其品系復雜，有關試劑缺乏，一般不常用作實驗對象。相比之下大鼠及小鼠的背景知識及相關試劑則較為全面，遺傳學、免疫學等方面的研究也較深入，且其EAE在臨床、病理、免疫及生化改變等方面都與人類脫髓鞘疾病較為相似，因此應用。

用大鼠制備EAE有許多優(yōu)點，如品系多，選擇余地大，繁殖快，同一品系中個體間差異小，實驗方便。其中Lewis大鼠誘發(fā)的EAE具有穩(wěn)定性好、敏感性高等特點，其病程為單相，多數(shù)可自行恢復，對再次誘發(fā)很快產(chǎn)生強的耐受性，多用作EAE激發(fā)和緩解機制的研究。而SJL/L及PL/J小鼠對再次誘發(fā)的敏感性沒有明顯降低，且?guī)缀蹩梢姷饺祟怣S的所有病理改變，可誘發(fā)出更接近于人類MS的緩解復發(fā)型EAE模型，但它的EAE發(fā)生率及潛伏期變化較大。人們對小鼠的遺傳背景了解得比較清楚，因此小鼠更適用于有關基因、細胞間作用等領域的研究。然而不同品系小鼠對EAE的敏感性也不同，有人將其分為EAE—易感（EAE—susceptible）和EAE—抵抗（EAE?resistant）兩種類型。基因型分析結果表明，單倍型為H?2s的小鼠（如SJL/J）及H?2q的小鼠（如DBA1/J）屬于EAE—易感型。C57BL/10J及P/J小鼠可發(fā)生輕微的脫髓鞘病變。BABL/C和AKR/J小鼠基本不發(fā)生EAE，被認為是EAE—抵抗小鼠。

不同品種或同一品種不同品系動物對EAE的易感性主要受免疫反應基因（Ir基因）影響，Ir基因的調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為T細胞表面受體對髓鞘堿性蛋白（MBP）的特異性表達。動物的種類不同，其受體表達能力不同，對自身抗原的反應性不同，因而對EAE的易感性也不同，因此在選擇動物時需要尋找EAE模型的敏感動物。

鑒于對EAE敏感的Lewis、DA大鼠，PL/J，SJL/J小鼠的價格昂貴、不宜獲得且難以飼養(yǎng)，國內(nèi)多采用價廉易得的Wistar大鼠，但其敏感性不及前者。

1998年Jon等用猴建立了EAE動物模型，與嚙齒類EAE模型相比，其特征更接近人類脫髓鞘疾病MS，并能以磁共振評估白質損害和神經(jīng)組織病理改變。

EAE發(fā)病有多種誘發(fā)因素，包括食物、藥物及感染等。大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境級別越高，清潔度越高，接觸誘發(fā)因素的幾率越小，在相同條件下致敏，其發(fā)病率就越低，因此選用普通動物即可。zui近有報道說明，EAE的發(fā)病還與動物的血腦屏障的形成有關。

EAE模型

1.2 年齡

EAE的發(fā)生發(fā)展與年齡密切相關。幼齡動物發(fā)病后癥狀很快達到高峰，隨后又迅速恢復，和成年動物相比病程較短，其抗原注射部位及CNS內(nèi)的炎性細胞浸潤程度較輕，并且幼齡動物體重偏小，一般情況差，易出現(xiàn)麻醉意外而死亡。若動物體重（周齡）偏大，則發(fā)病延遲，且癥狀較重，所以選擇受試動物以青年期為佳。但若作為抗原提供者，其年齡可適當放寬，一般大于4周即可。

EAE模型

1.3 性別

MS多為青年女性，EAE的發(fā)生發(fā)展也存在性別差異。一般來講，雌性動物較雄性敏感，表現(xiàn)在雌性動物的發(fā)病率高，臨床癥狀相對嚴重，如Wistar大鼠及SJL/J小鼠，但也有的動物如Lewis大鼠，雄性較雌性敏感。另外實驗時間選擇在夏季比冬春季節(jié)誘導動物模型的敏感性更高。敏感性高的動物，有時癥狀較嚴重且死亡率高，應引起注意。

EAE模型抗原的選擇

常用的致敏抗原有髓鞘堿性蛋白（MBP）或其多肽片斷（如MBP peptide 89—101）以及蛋白脂（PLP）等。長期以來MBP和PLP被認為是引起EAE和MS的主要抗原，MBP是髓鞘中抗原性zui強的蛋白質，占髓鞘總蛋白的40%，等電點在10以上，是強堿性蛋白質。研究表明MBP可激活體內(nèi)Th+細胞，使之穿過血腦屏障，攻擊自身神經(jīng)髓鞘的MBP，從而導致中樞神經(jīng)白質脫髓鞘，引起EAE或MS。近年來多用MBP肽代替MBP免疫動物。PLP是高度疏水的膜蛋白，對PLP不同肽決定簇發(fā)生反應的CD4+T細胞能誘導急性、慢性復發(fā)型及慢性進展型EAE。在MS患者體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)與PLP抗原決定簇發(fā)生反應的T細胞。

zui近研究表明，體內(nèi)含量較少的髓蛋白，如髓寡樹突細胞糖蛋白（MOG）、髓堿相關糖蛋白（MAG）等也是很強的抗原。髓鞘素（Myelin）、脊髓組織勻漿（SCH）、腦組織勻漿（BH）等也可作為致敏抗原。某些非髓性蛋白，如神經(jīng)原蛋白（neuronal protein,S100β）、膠原纖維酸蛋白（GFAP）也參與EAE的發(fā)病。

通常不同品種動物對同一抗原的敏感性不同、不同抗原的抗原性也不同，并且不同來源的同一抗原的活性也有明顯差異。一般情況下，抗原性強弱依次為豚鼠脊髓>大鼠脊髓>牛脊髓，脊髓組織>腦組織，豚鼠MBP>牛MBP。蛋白或多肽單體不但結構明確，而且可以定量，因此利于進行EAE發(fā)病機制研究，但不易獲得。脊髓勻漿和腦組織勻漿兩種抗原均含有多種抗原表位，且易于獲得，適用于多種動物，但其成分復雜，不易定量，這給某些特殊研究造成不便。誘導鼠類產(chǎn)生EAE的異種抗原，以新鮮豚鼠脊髓制備的抗原佐劑乳化物為。在一定范圍內(nèi)抗原的量和EAE的發(fā)病率及發(fā)病程度有相關性，注射抗原佐劑乳化物的劑量越大，EAE的發(fā)病率越高?？乖膭┝靠梢騽游锏钠废怠⒖乖N類、免疫方法、研究目的等的不同而有很大變化。另外，抗原的物理狀態(tài)也很重要，高分散度的抗原易于被吞噬和遞呈，進而較率地激活免疫系統(tǒng)。

EAE模型佐劑的選擇

提取的抗原需與佐劑混合制成抗原乳劑后才能致敏動物。抗原佐劑為非特異性免疫增強劑，它可改變抗原的物理性狀，延長抗原在體內(nèi)的儲留時間，刺激抗原提呈細胞及淋巴細胞，從而增強和擴大免疫應答效果，它還能引起遲發(fā)性血腦屏障通透性增加和自身免疫反應。zui常用的佐劑為*弗氏佐劑（CFA），CFA在提高抗體的幅度和持久性方面是當今作用zui強的佐劑。國外一般均采用人型結核桿菌（H37Ra）作為弗氏佐劑。不同實驗室所用的致敏抗原及佐劑中分枝結核桿菌蛋白濃度有所差別，提高結核桿菌的濃度，可提高EAE 的發(fā)生率及復發(fā)率，但也容易引起注射部位壞死。由于H37Ra在國內(nèi)不易獲得，常采用廉價易得的卡介苗（BCG）來代替。

百日咳桿菌疫苗（BPV）毒素能增加血管壁的通透性和血管表面粘附分子的表達，有利于致敏的T細胞透過血腦屏障，攻擊神經(jīng)髓鞘，造成對腦、脊髓組織的免疫損傷。于FCA中加入BPV可明顯縮短Wistar大鼠EAE的潛伏期，提高其發(fā)病率，加重其臨床癥狀，對EAE有明顯的促發(fā)作用。在用GPSCH誘導Wistar大鼠EAE的同時，給予BPV 可使EAE的潛伏期、發(fā)病率、臨床癥狀、體重及病理改變等方面與敏感的Lewis大鼠EAE的上述表現(xiàn)近似。

EAE模型模型制備方法

EAE是實驗動物通過神經(jīng)組織（其中的某些成分）或病毒誘導產(chǎn)生的。EAE的誘導有主動誘導法和被動誘導法兩種。不同的免疫方法，可影響抗原遞呈，激發(fā)不同的免疫反應，這不但影響EAE的發(fā)生率，還可影響其發(fā)展與轉歸。

通常采用主動誘導法制備EAE模型，將抗原與佐劑的混合乳劑直接注射至動物體內(nèi)，經(jīng)過一定時間的潛伏期，誘導EAE的產(chǎn)生?？乖⑸洳课坏牟煌?，可影響EAE的發(fā)生率、潛伏期、死亡率及復發(fā)率。常用的注射部位有腳墊、頸部及背部（皮下、皮內(nèi)、肌肉）、腹腔和尾靜脈等多種，其中以皮下多點注射及腳墊注射的發(fā)病率zui高，而頸部注射則有較高的復發(fā)率。 因多次注射易引發(fā)免疫耐受，現(xiàn)在多采用單次注射抗原法。

EAE的被動轉移實驗是研究其發(fā)病機制的zui直接證據(jù)，也是研究EAE的治療及預防措施的良好模型。將抗原激活的PLP特異性T細胞轉輸給同一品系的正常大鼠或小鼠，也可引起EAE。MBP特異性自身反應性T細胞在MS的發(fā)病機制中也起著關鍵作用，T細胞必須先在外周活化，通過血管內(nèi)皮細胞進入CNS才能致病。

EAE模型臨床表現(xiàn)

EAE模型5.1 癥狀分級

EAE的神經(jīng)癥狀通常根據(jù)Kono等提出的標準分為5級。0級：無任何臨床癥狀；1級：動物尾巴無力，2級：尾部無力+肢體無力，3級：肢體輕度麻痹，4級：肢體嚴重麻痹，被動翻身后不能復原；5級：瀕死狀態(tài)或死亡。

EAE模型5.2 發(fā)病過程

抗原誘導EAE后，如果發(fā)病，一般都在注射抗原佐劑乳化物后10d左右開始出現(xiàn)癥狀，第2～3周癥狀達高峰。有報道Lewis大鼠用豚鼠全脊髓勻漿誘發(fā)EAE時其潛伏期為12.1 dpi（10～14 dpi），發(fā)病率為51/53，臨床評分一般在2.5～3.5分左右。采用BCG和Wistar大鼠建立的EAE模型，其發(fā)病率穩(wěn)定在50%左右。存活者常在注射抗原后3周左右癥狀自行緩解，一月左右基本恢復。隨癥狀緩解，體重也逐漸恢復。如果注射抗原3周后未出現(xiàn)EAE癥狀，則不再發(fā)病。

EAE模型小結

EAE是由針對CNS髓鞘發(fā)生免疫攻擊的CD4+Th1細胞介導的自身免疫性疾病，抗原致敏的T細胞穿過血腦屏障進入中樞，誘發(fā)對自身髓鞘抗原的免疫應答，導致腦及脊髓的免疫損傷。EAE是人類MS的經(jīng)典動物模型，通過對EAE發(fā)病機制、病情發(fā)生發(fā)展規(guī)律、臨床及病理改變、治療及預防等方面的深入研究，能夠為MS的治療提供充分的實驗依據(jù)。

相關試劑